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        補腎活血方對子宮內膜干細胞移植治療薄型子宮內膜大鼠子宮內膜形態學的影響

        作者:mac 來源:文閱期刊網 日期:2021-07-15 08:48人氣:
          摘    要:目的 探討補腎活血方對子宮內膜干細胞(EDSCs)移植治療薄型子宮內膜模型大鼠子宮內膜形態學的影響。方法 從8周齡雌性SD大鼠子宮內膜中分離提取EDSCs,采用機械分離與兩步酶消法,實驗選用純度較高的第3代細胞,分別采用尾靜脈(IV)和宮腔注射(IU)的方法移植到實驗大鼠體內。采用宮腔灌注95%無水乙醇及灌胃羥基脲加尾靜脈注射高分子右旋糖酐方法建立腎虛血瘀薄型子宮內膜聯合模型。將實驗大鼠分為正常組、模型組、戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組,每組8只。各組大鼠給予相應的方法干預后,經過3個動情周期處死后取材。采用HE染色觀察各組子宮內膜厚度、腺體和血管分布情況,免疫組化、Western blot檢測角蛋白、波形蛋白的表達情況。結果 在改善子宮內膜厚度方面,EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組及EDSCs+IU+中藥組較模型組內膜厚度均增加,差異有統計學意義(P<0.01);在增加子宮內膜腺體數方面,EDSCs+IV組較模型組腺體數增加,差異有統計學意義(P<0.05),EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組腺體數增加,差異有統計學意義(P<0.01);在增加子宮內膜血管數方面,EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組血管數增加,差異有統計學意義(P<0.01);在改善角蛋白表達方面,EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組表達量升高,差異有統計學意義(P<0.01);在改善波形蛋白表達方面,EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組表達量升高,差異有統計學意義(P<0.01);在改善子宮內膜厚度、免疫組化檢測波形蛋白表達方面宮腔注射EDSCs與尾靜脈注射EDSCs比較,差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組比較、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較子宮內膜厚度顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01)。結論 宮腔注射EDSCs在增加子宮內膜厚度、免疫組化檢測波形蛋白表達方面更優于尾靜脈注射EDSCs;加用補腎活血方后有助于增加子宮內膜厚度。
          
          關鍵詞:補腎活血方 薄型子宮內膜 模型大鼠 子宮內膜干細胞移植 子宮內膜形態學 中藥研究
          
          Effect of Bushen Huoxue Decoction on endometrial morphology of thin endometrial rats treated with endometrial stem cell transplantation
          
          YIN Xiaodan HE Junqin XIN Mingwei WU Ying HAN Qian YANG Wei
          
          Department of Traditional Chinese Medicine,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University;
          
          Abstract:Objective To investigate the effect of Bushen Huoxue Decoction on endometrial morphology in rats with thin endometrium treated by transplantation of endometrial stem cells(EDSCs). Methods EDSCs were isolated from the endometrium of 8-week-old female SD rats by the methods of mechanical separation and two-step enzyme elimination. The third generation cells with high purity were selected and transplanted into the experimental rats by tail vein and intrauterine injection respectively. The combined model of thin endometrium with kidney deficiency and blood stasis was established by infusing 95% ethanol without water into the uterine cavity and injecting hydroxyurea and high molecular dextran into the tail vein of female SD rats. The experimental rats were divided into normal control group, model group, estradiol valerate group, EDSCs + IV group, EDSCs + IU group,EDSCs + IV+ traditional Chinese medicine( TCM) group and EDSCs + IU + TCM group,with 8 rats in each group. After intervention with corresponding methods,the rats in each group were killed after 3 estrous cycles. HE staining was used to observe the thickness of uterus,the number of glands and blood vessels,and the expressions of keratin and vimentin by immunohistochemistry and Western blot. Results In terms of improving endometrial thickness,the endometrial thickness in the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of increasing the number of endometrial glands,the number of glands in the EDSCs+IV group was significantly higher than that in the model group( P < 0. 05),and that in the EDSCs + IU group,the EDSCs + IV + TCM group and the EDSCs + IU + TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of increasing the number of endometrial blood vessels,the number of blood vessels in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of improving the expression of keratin,the expression of keratin in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU +TCM group was significantly higher than that in the model group( P < 0.01); in terms of improving the expression of vimentin,the expression of vimentin in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU +TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01). There was significant difference between intrauterine injection of EDSCs and tail vein injection of EDSCs in improving the thickness of endometrium and the expression of vimentin detected by immunohistochemistry( P<0.01). The endometrial thickness in the EDSCs+IV+TCM group was significantly higher than that in the EDSCs+IV group,and that in the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the EDSCs+IU group( P<0.01). Conclusion Intrauterine injection of EDSCs is better than tail vein injection in increasing endometrial thickness and vimentin expression detected by immunohistochemistryl,and adding Bushen Huoxue Decoction helps to increase the thickness of endometrium.
          
          Keyword:Bushen Huoxue Decoction; thin endometrium; model rats; endometrial stem cell transplantation; endometrial morphology; traditional Chinese herbol medicine research;
          
          薄型子宮內膜(thin endometrium)通常是指當卵泡發育成熟(直徑≥18 mm)時或人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)注射日,子宮內膜厚度≤7 mm[1]。其主要臨床表現為月經量過少,進而影響胚胎種植,導致不孕,甚至增加自然流產的風險。有研究表明,子宮內膜容受性差,人類胚胎無法著床,進而可導致妊娠失敗[2]。薄型子宮內膜的病因尚未明確。有研究發現,薄型子宮內膜的形成主要與子宮內膜雌、孕激素效能下降[3]、宮腔刮宮等操作史[4]、長期(≥5年)服用復方口服避孕藥等有關[5]。子宮內膜干細胞(endometrial stem cells, EDSCs)是一種成體干細胞,致癌風險低,操作簡單,可以從人的月經血、子宮內膜等組織中分離、培養[6],在嚴格的操作規范下可以大規模生產,這為EDSCs用于治療薄型子宮內膜等內膜因素導致的胚胎無法著床等引起的不孕提供了可能性[7],但在實際應用中仍存在分離后缺乏EDSCs特異性表面標記物鑒定以及EDSCs數量少、歸巢位置不明確以及分化能力差等問題。因此,在采用EDSCs治療薄型子宮內膜過程中如何增加EDSCs移植數量、促進EDSCs定向歸巢等是亟待解決的問題。
          
          諸多研究表明,中醫藥對于薄型子宮內膜的防治具有多靶點、療效好、副作用少等優勢,加用中藥促進移植EDSCs的歸巢、提高治療效果成為EDSCs移植治療薄型子宮內膜基礎研究的新方向。為此,本研究采用腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠聯合模型,擬通過補腎活血方干預不同的移植EDSCs方式作用下的大鼠,觀察其對薄型子宮內膜大鼠子宮內膜形態學的影響,進而為進一步探討補腎活血方調控EDSCs向子宮內膜靶向歸巢奠定基礎。
          
          1 材料與方法
          
          1.1 材料
          
          1.1.1 動物
          
          SPF級8~10周雌性SD大鼠70只,體質量(220±30)g, 標準顆粒飼料及潔凈飲用水喂養,均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物生產許可證號:SCXK(京) 2016-0004。動物使用許可證號:SYXK(京)2015-0004。動物飼養于北京農學院,適應環境3 d, 自由飲水、進食,室溫(22±1)℃,濕度(40±10)%,光照周期12 h/12 h。動物倫理號:20190801LL。
          
          1.1.2 藥物與試劑
          
          補腎活血方組成:淫羊藿10 g, 肉蓯蓉10 g, 鹿角15 g, 熟地黃10 g, 菟絲子10 g, 覆盆子10 g, 枸杞子10 g, 山茱萸10 g, 丹參10 g, 赤芍10 g, 生蒲黃10 g, 雞血藤15 g, 紅花10 g, 當歸10 g, 川芎10 g, 澤蘭10 g, 益母草12 g, 牛膝10 g, 柴胡6 g, 香附10 g, 木香6 g, 羌活6 g, 細辛3 g。上述藥物經煎煮濃縮后調整濃度至4 g/mL(人服用劑量為1劑/d),放置于4 ℃冰箱貯存備用。以上藥物由北京同仁堂有限公司加工提供。
          
          戊酸雌二醇(補佳樂,1 mg/片),拜耳公司(批號:J20130009),人用量3 mg/d。按照人的體質量70 kg, 大鼠與人的等效劑量比值是6.3,故確定大鼠的用藥劑量為0.3 mg·kg-1·d-1。
          
          羥基脲,齊魯制藥有限公司(批號:H37021289),人用量5 g/d。按照人的體質量70 kg, 大鼠與人的等效劑量比值是6.3,故確定大鼠的用藥劑量為450 mg· kg-1·d-1。
          
          高分子右旋糖酐(Dextran70), 瑞士Amwesham Biosciences公司。參照文獻[8],確定大鼠的用藥劑量為5 mL/kg。
          
          L-DMEM培養基,美國Gibco公司(批號:11885084);胰蛋白酶,美國Gibco公司(批號:25200056);胎牛血清,美國Gibco公司(批號:10099133C);青霉素、鏈霉素,美國Gibco公司(批號:10378016);無水乙醇,國藥集團化學試劑有限公司(批號:10009218);蘇木精染色、伊紅染液、生物素標記的山羊抗兔IgG,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;波形蛋白一抗、角蛋白一抗,美國Abcam公司(批號:ab8069、ab8068)。
          
          1.1.3 儀器
          
          超凈工作臺,蘇州凈化工程公司(型號:YJ-875S);臺式高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司(型號:TGL-16M);細胞培養箱,美國Thermo Scientific公司(型號:311);倒置顯微鏡,日本Olympus株式會社(型號:BX60);光學顯微鏡,南京江南光電股份有限公司(型號:XD-202);全自動包埋機,武漢俊杰電子有限公司(型號:JB-P5)。
          
          1.1.4 EDSCs的分離及培養
          
          取大鼠子宮,觀察子宮大體標本,并縱行剖開部分子宮暴露宮腔觀察,后浸入4%多聚甲醛中固定待查。將手術取得的組織用PBS沖洗3次,加入膠原酶Ⅲ(300 mg/L)+DNA酶(40 mg/L),置于30 ℃恒溫水浴搖床(150 r/min)消化45 min, 加入含10%FBS的DMEM/F12培養液終止消化,100目濾網過濾,收集濾液。400目濾網過濾,分離基質細胞(<400目)。收集懸液,1 000 r/min離心10 min, 棄上清,沉淀用1 mL培養液重懸,緩慢滴加到含有8 mL培養液的離心管內,400 r/min離心3 min, 去除成團細胞。將上清液轉移到另一離心管中,1 000 r/min離心10 min, 棄去上清液,底部沉淀即為純化的子宮內膜基質細胞。用含20%FBS的DMEM/F12培養液重懸細胞,置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養4 h后換液,去除不貼壁細胞,倒置顯微鏡下連續動態觀察細胞生長及形態特征。上述細胞原代細胞鋪滿90%瓶壁時用0.25%胰酶-0.1%EDTA消化液消化,1∶2傳代。根據前期實驗基礎,P1、P3、P5細胞生長曲線趨勢相似,在體外培養的前3天,細胞生長緩慢,曲線較平緩,為細胞生長的潛伏生長期,第3~5天細胞生長迅速,為生長周期的指數增生期,培養第6天后細胞生長幾乎停止,為生長平臺期。通過比較3代細胞的生長曲線,可發現P5增長速度較P1、P3慢,有較長的細胞倍增時間,P3細胞形態趨于一致,細胞表型穩定,可以獲得高出度的EDSCs, 因此取P3細胞凍存備用。
          
          1.2 造模
          
          腎虛血瘀薄型子宮內膜模型的建立參照參考文獻[8-10],根據前期實驗基礎成模率約為80%。SD大鼠采用羥基脲450 mg·kg-1·d-1給大鼠灌胃,每日1次,連續8 d, 于實驗末次給藥30 min后尾靜脈快速推注10%高分子右旋糖酐5 mL/kg。給羥基脲8 d后,發現大鼠被毛枯槁欠光澤,體型瘦小,耳、爪、尾部顏色偏暗,以及精神萎靡、大便溏等腎虛癥狀;尾靜脈快速注射10%高分子右旋糖酐后,觀察發現大鼠耳、爪、尾部顏色紫暗,提示有血瘀,最終造成腎虛血瘀模型。將腎虛血瘀模型SD大鼠麻醉、固定、備皮、常規消毒,從尿道口上端約3 cm處正中縱向切開皮膚約2~3 cm, 逐層分離進入腹腔,在膀胱后方找到子宮,呈“V”型,在其下端匯合處用血管夾夾住,用無齒鑷將一側子宮拉直,子宮周圍墊有無菌紗布,在宮角下0.5 cm處以1 mL針管沿子宮長軸進入宮腔,注入95%的無水乙醇,見子宮膨隆且針孔處無明顯液體流出(注入液體約0.3 mL),即停止注藥,保持針頭在宮腔內;為保證宮腔的充盈狀態,2 min后再次緩慢注藥,如此重復,使液體在宮腔貯留5 min, 取出針頭。另一側子宮操作如上,反復沖洗腹腔,用棉墊將沖洗液吸干,恢復子宮解剖位置,逐層關腹。
          
          造模成功后,隨機取3只動物,經過3個動情周期后的動情期,開腹取子宮,觀察大體標本,4%多聚甲醛固定。HE染色,在光學顯微鏡下讀片,在低倍鏡下觀察,攝片。釆用Leica Qwin Plus圖像處理軟件測定子宮內膜厚度,即子宮內膜肌層交接處至宮腔的垂直距離,每張片子選取5個部位,取平均值作為該切片的子宮內膜厚度,以證實薄型子宮內膜模型制作成功。模型組大鼠出現拱背,蜷縮少動,反應較為遲鈍,背部被毛疏松不光亮,脫毛,大便偏稀,部分出現便溏等為造模成功,并且觀察發現大鼠耳、爪、尾部顏色紫暗等,提示腎虛血瘀模型造模成功[11]。
          
          1.3 分組與干預
          
          造模成功率約80%左右,取存活的56只SD大鼠隨機分為7組,每組8只。
          
          (1)正常組:
          
          灌服0.9%NaCl溶液。
          
          (2)模型組:
          
          建立腎虛血瘀薄型子宮內膜模型后,灌服0.9%NaCl溶液。
          
          (3)戊酸雌二醇組:
          
          建模后,灌服戊酸雌二醇。
          
          (4)EDSCs+IV組:
          
          建模后,經尾靜脈注射(IV)移植含1×107EDSCs的PBS細胞懸液體1 mL。
          
          (5)EDSCs+IU組:
          
          建模后,經宮腔注射(IU)移植含1×107EDSCs的PBS細胞懸液體1 mL。
          
          (6)EDSCs+IV+中藥組:
          
          建模后,經尾靜脈移植含1×107 EDSCs的PBS細胞懸液體1 mL,并灌服補腎活血方。
          
          (7)EDSCs+IU+中藥組:
          
          建模后,經宮腔移植含1×107 EDSCs的PBS細胞懸液體1 mL,并灌服補腎活血方。
          
          補腎活血方劑量參照《藥理實驗方法學》[12]中人鼠等效劑量換算。人用:1劑/d, 223 g/劑。按照人的體質量70 kg, 大鼠與人的等效劑量比值是6.3,故大鼠的劑量為:1劑·d-1/70 kg×6.3=0.09劑·kg-1·d-1=20.07 g·kg-1·d-1。前期課題組實驗已確定補腎活血方的最佳使用劑量為高劑量,約為40.1 g·kg-1·d-1,故實驗中灌胃均采用此劑量,1次/d, 連續3個動情周期。
          
          于移植后經過大鼠3個動情周期,取出大鼠子宮,部分用4%多聚甲酸固定,部分置入液氮中凍存備用。
          
          1.4 檢測指標與方法
          
          1.4.1 EDSCs細胞形態觀察
          
          倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態特征。鏡下可見EDSCs呈長梭形,成纖維細胞樣,可見粗細不等的胞質突起。
          
          1.4.2 HE染色
          
          常規HE染色后,在光鏡下觀察子宮各層厚度變化、腺體和血管分布情況、腔上皮或者腺上皮細胞形態學變化。釆用Leica Qwin Plus圖像處理軟件測定子宮內膜厚度,即子宮內膜肌層交接處至宮腔的垂直距離,每張片子選取5個部位,取平均值作為該切片子宮內膜厚度。低倍鏡下根據腺體和血管的形態,計數子宮內的腺體數和血管數。
          
          1.4.3 免疫組化檢測子宮內膜細胞角蛋白、波形蛋白表達
          
          (1)抗原修復:
          
          0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)1 000 mL倒入燒杯,置燒杯于微波爐中加熱至沸騰,再把裝好石蠟子宮切片的切片架放到燒杯內,保證切片完全浸沒在修復液中,放微波爐中繼續中火10 min, 取出后待其自然冷卻;用PBS輕輕漂洗3次,每次3 min。
          
          (2)阻斷內源性過氧化物酶:
          
          每張玻片上滴加3%H2O2溶液,置室溫10 min; PBS漂洗3次,每次3 min; 甩干玻片上水分,滴加一抗覆蓋切片組織,其中角蛋白抗體稀釋比例1∶50;波形蛋白抗體稀釋比例1∶200,整合素β3抗體稀釋比例1∶100,放入濕盒內,4 ℃孵育過夜;第2天取出濕盒在常溫下復溫45 min, 再PBS漂洗3次,每次3 min; 滴加二抗,50 μL/片,37 ℃靜置30 min, 其中角蛋白、整合素β3滴加山羊抗兔抗體多聚體;波形蛋白滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體;PBS漂洗3次,每次3 min。
          
          (3)DAB顯色:
          
          取1滴DAB濃縮液加入1 mL DAB底物緩沖液避光混勻,制成DAB工作液(30 min內使用),每張玻片滴加DAB工作液顯色2~3 min, 顯微鏡下觀察染色情況,待染色結束用自來水沖洗。
          
          (4)復染:
          
          置玻片于蘇木素染液中,復染5~10 min, 自來水沖洗。
          
          (5)分化:
          
          置玻片于1%鹽酸乙醇中,分化30 s, 自來水沖洗30 min。
          
          (6)封片:
          
          甩干玻片,滴加適量中性樹膠,并用蓋玻片封片。顯微鏡下觀察子宮內膜細胞角蛋白、波形蛋白表達情況。
          
          1.4.4 Western blot法檢測子宮內膜細胞角蛋白和波形蛋白
          
          取出凍存在液氮中組織稱重,然后放入已預冷的研缽中進行研磨,變研磨邊加入液氮,直至成粉末狀;加入預冷的細胞裂解液1 mL(含PMSF)冰上裂解30 min; 4 ℃、12 000 r/min離心10 min, 棄去沉淀,取上清液進行蛋白分光光度儀定量。組織蛋白法進行蛋白濃度測定;SDS-PAGE電泳;轉膜和封閉;封閉與抗體解育免疫反應;化學發光,顯影,定影;圖像分析。應用膠片瞬變顯示系統掃描膠片,Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值(OD),將待測蛋白條帶與同一泳道β-actin條帶的光密度比值作為結果。
          
          1.5 統計學方法
          
          采用 SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以x¯±s表示 ,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以 P<0.05為差異有統計學意義。
          
          2 結果
          
          2.1 對EDSCs細胞形態的影響
          
          倒置顯微鏡下觀察可見細胞量多,且主要是圓形細胞懸浮于培養液中,約24 h后即可見少量貼壁細胞,且細胞形態不一;3 d后觀察可見貼壁細胞明顯增多,多呈梭形;培養4~5 d后可見貼壁細胞呈漩渦狀或輻射式生長;7~10 d后即可見細胞集落融合成片,鋪滿培養瓶底部,經消化傳代后的細胞貼壁較快,后續實驗選P3代細胞進行實驗。見圖1。
          
          圖1 子宮內膜干細胞(EDSCs)形態(×100)
          
          2.2 子宮內膜HE染色結果
          
          對照組子宮內膜結構完整,呈波浪形,腺上皮和腔上皮細胞完整,呈立方狀,腺體和血管數量正常;模型組子宮內膜厚度明顯變薄,腺上皮和腔上皮細胞呈扁平狀,腺體稀少,毛細血管數量減少,內膜連續性差;戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組各組內膜厚度均有不同程度的增加,腺體數和血管數也有不同程度的增多。見圖2。
          
          圖2 各組大鼠子宮內膜形態(HE染色,×40)
          
          2.3 各組子宮內膜厚度的比較
          
          模型組較正常組內膜厚度降低,差異有統計學意義(P<0.01)。戊酸雌二醇組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組內膜厚度均增加,差異有統計學意義(P<0.01)。EDSCs+IV組較模型組差異無統計學意義(P>0.05)。EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組比較,內膜厚度差異有統計學意義(P<0.01)。EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,內膜厚度差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。
          
          表1 各組大鼠子宮內膜厚度比較(n=8,x¯±s,μm)
          
          2.4 各組子宮內膜腺體數的比較
          
          模型組較正常組腺體數減少,差異有統計學意義(P<0.01)。戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組較模型組腺體數增加,差異有統計學意義(P<0.05)。EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組腺體數增加,差異有統計學意義(P<0.01)。EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,腺體數差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。
          
          表2 各組大鼠子宮內膜腺體數比較(n=8,x¯±s,個)
          
          2.5 各組子宮內膜血管數的比較
          
          模型組較正常組血管數減少,差異有統計學意義(P<0.01)。戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組血管數增加,差異有統計學意義(P<0.01)。EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,血管數差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。
          
          表3 各組大鼠子宮內膜血管數比較(n=8,x¯±s,個)
          
          2.6 各組免疫組化檢測角蛋白、波形蛋白表達的比較
          
          角蛋白:模型組較正常組降低,差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組差異無統計學意義(P>0.05);戊酸雌二醇組、EDSCs+IU組較模型組升高,差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。
          
          波形蛋白:模型組較正常組表達量降低,差異有統計學意義(P<0.01);戊酸雌二醇組、EDSCs+IU+中藥組較模型組升高,差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IU組較模型組表達量顯著升高(P<0.05);EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組較模型組有升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05);EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖3、圖4。
          
          表4 各組免疫組化檢測角蛋白、波形蛋白 表達的比較(n=8,x¯±s)
          
          圖3 各組免疫組化檢測角蛋白表達的比較(×100)
          
          圖4 各組免疫組化檢測波形蛋白表達的比較(×100)
          
          2.7 各組Western blot檢測角蛋白、波形蛋白表達的比較
          
          角蛋白:模型組較正常組表達量降低,差異有統計學意義(P<0.01);戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組表達量升高,差異有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。
          
          波形蛋白:模型組較正常組表達量降低,差異有統計學意義(P<0.01);戊酸雌二醇組、EDSCs+IV組、EDSCs+IU組、EDSCs+IV+中藥組、EDSCs+IU+中藥組較模型組表達量升高,差異均有統計學意義(P<0.01);EDSCs+IU組與EDSCs+IV組、EDSCs+IV+中藥組與EDSCs+IV組、EDSCs+IU+中藥組與EDSCs+IU組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5、圖5。
          
          表5 各組角蛋白、波形蛋白表達的比較(n=8,x¯±s)
          
          3 討論
          
          研究發現,人子宮內膜組織中存在干細胞,有上皮干細胞和間質干細胞兩種類型,而功能層與基底層中存在大量的間質干細胞[13]。近年來研究發現,越來越多的學者認為薄型子宮內膜的發生與子宮內膜中的干細胞受損及減少有關。且種種研究表明,移植干細胞可能會參與子宮內膜形成[14-15]。但在實際應用中仍存在分離后缺乏EDSCs特異性表面標記物鑒定以及EDSCs數量少、歸巢位置不明確以及分化能力差等問題。因此,在采用EDSCs治療薄型子宮內膜過程中,如何增加EDSCs移植數量、促進EDSCs定向歸巢等是近年來研究的熱點。
          
          中醫古籍中沒有對“薄型子宮內膜”的病名記載,薄型子宮內膜的臨床表現主要是月經過少或不孕,故中醫將本病多歸結為“經水澀少”“不孕”等。我科室臨床中對1 000多例薄型子宮內膜患者進行的證候要素聚類分析結果顯示,聚為四類時,第一類的證候主要為月經色暗紅、痛經、經期肛門墜脹、腰膝酸軟、面色晦暗、胸脅刺痛、腰痛耳鳴、舌紫暗、舌苔薄、脈沉澀,證型名稱為腎虛血瘀證,所占比例最大,為42.28%。因此,補腎填精、養血活血是通過中醫藥改善薄型子宮內膜的關鍵[16]。
          
          本研究所采用的補腎活血方是我院中醫科創始人趙松泉主任總結幾十年臨床經驗所創制的,主要由補腎藥配伍活血藥而成。方中淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角溫補腎陽;熟地黃、菟絲子、覆盆子、枸杞子、山茱萸,滋補肝腎之陰;丹參、赤芍、生蒲黃、雞血藤、紅花、當歸、川芎、澤蘭、益母草補血、養血、活血,疏通經脈、化瘀生新。課題組前期對補腎活血方進行了大量研究,結果提示,補腎活血方不僅能夠調控Wnt/β-catenin 信號通路,增加子宮內膜厚度、腺體數、血管數,有效改善子宮內膜容受性相關指標,促進內皮細胞增殖、遷移,還可以通過增加VEGF等的表達促進血管新生[17-18]。但在補腎活血方促進EDSCs移植治療薄型子宮內膜方面為初次涉及。
          
          本研究主要觀察補腎活血方聯合不同的移植EDSCs方式對腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠子宮內膜形態學的影響。干細胞可通過其無限自我更新和增殖分化的能力促進子宮內膜的再生和修復,因此在治療薄型子宮內膜方面有良好的前景[19]。EDSCs被確認為標志保留細胞,可能通過間充質細胞到上皮細胞的轉化,顯示出在子宮內膜修復和再生中的作用,而且EDSCs可以很容易且無創地獲得,具有廣泛擴增和快速擴增的特性。EDSCs在治療薄型子宮內膜方面有再生和修復的作用,其作用機制可能為通過促進波形蛋白、VEGF以及細胞角蛋白的表達,從而重建子宮內膜[20]。
          
          本研究結果發現,宮腔注射EDSCs在增加子宮內膜厚度以及波形蛋白表達方面更優于尾靜脈注射EDSCs, 這可能是因為宮腔注射更加直接,使得EDSCs能夠歸巢到宮腔,能夠迅速分化成子宮內膜細胞,從而增加子宮內膜厚度;尾靜脈注射的EDSCs可能歸巢到到宮腔的數量會下降,從而效果不如宮腔直接注射。加用補腎活血方后能更好的增加子宮內膜厚度。補腎活血方對于EDSCs移植治療薄型子宮內膜容受性其他方面指標的影響有待課題組進一步研究和探討。
          
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